Nel 1450 venne chiamato a Montefalco dai frati francescani, per i quali affrescò il monastero di San Fortunato. Pochi anni dopo, Fra Jacopo da Montefalco, teologo e predicatore, gli propose di realizzare gli affreschi della Chiesa di San Francesco sul tema dell'identificazione tra San Francesco e Gesù Cristo. I dipinti (oggi chiesa-museo) furono eseguiti nel 1452 e rivestono interamente l'abside centrale. Negli stipiti dell'abside, a destra e a sinistra, due cartigli riportano il nome dell'artista e del committente con questa lode: "Qualis sit pictor prefectus inspice tector". Nell'abside centrale il famoso ciclo delle Storie della vita di San Francesco, gli affreschi che hanno sancito la prima straordinaria testimonianza dell'avvenuto raggiungimento dello status d'artista indipendente da parte di Benozzo Gozzoli.
Per rendere le scene più comprensibili dai suoi contemporanei, Benozzo ha utilizzato durante la pittura dei riferimenti che per i tempi erano contemporanei, come architetture e paesaggi caratteristici della sua epoca. Le storie si sviluppano in dodici riquadri sulle pareti divise da sei pilastrini che proseguono sui costoni della volta. Gli episodi della vita di San francesco sono diciannove e, volutamente, non rispettano l'ordine cronologico degli avvenimenti in quanto Fra Bonaventura (il biografo di San Francesco) aveva autorizzato questo tipo di narrazione per favorire un approccio tematico alla vita del Santo. Gli episodi si concludono comunque con San Francesco in cielo insieme ai cinque santi appartenenti all'Ordine in Gloria tra gli angeli.
La "Madonna della Cintola", conservata presso i Musei Vaticani, è stata dipinta a Montefalco
