Questo affascinante, ma impegnativo percorso prende il via da Piazza Matteotti, nella parte alta di Assisi. L'itinerario, lungo poco meno di 35 chilometri, si caratterizza per la difficile e ripida scalata al monte Subasio, che in alcuni punti presenta pendenze superiori al 20% e perciò è adatta solo a biker con un ottimo grado di allenamento. Chi volesse "alleggerire" in parte le difficoltà del tracciato, può affrontare l'itinerario anche in senso inverso: c'è sempre da scalare il Subasio, ma dal versante di Spello la salita presenta pendenze meno severe.

Lasciando Piazza Matteotti svoltate subito a destra seguendo le indicazioni per il Monte Subasio: uscendo da Porta Cappuccini iniziate immediatamente la salita verso la cima. Visto che la partenza è subito molto impegnativa, si consiglia qualche minuto di riscaldamento, magari visitando il centro di Assisi, prima di iniziare l'itinerario. Dopo 300 metri, appena superata Porta Cappuccini, lasciate l'asfalto svoltando a sinistra e seguite il sentiero n. 50: la prima parte dell'ascesa è sicuramente la più impegnativa e può costringere anche a mettere piede a terra a causa della pendenza e del fondo sconnesso. L'ascesa, che si sviluppa costantemente all'ombra di un fitto bosco, in poco meno di 6 chilometri conduce in località Gli Stazzi, quasi in vetta al Subasio. Qui, uscite dal bosco e attraversate la strada asfaltata, proseguendo sullo sterrato a mezza costa che attraversa l'intera montagna.

A questo punto la parte più difficile dell'itinerario è già alle spalle e il sentiero, che si sviluppa appena sotto la vetta del Subasio, vi ripagherà dello sforzo offrendo panorami assolutamente mozzafiato. Dal chilometro 8,5 al chilometro 12,5 pedalate su un single track prima di reimmettervi sulla strada sterrata che in 5 chilometri di discesa vi conduce a Collepino (km17,4). Qui, tornando sull'asfalto e svoltando a destra, si continua a scendere tra gli ulivi verso Spello, dove una sosta per visitare il centro storico è d'obbligo. 

Da Spello proseguite a destra e al chilometro 22,7 girate a destra in via degli Ulivi, percorrendola fino a Capodacqua (km 25,9). Lasciate di nuovo l'asfalto e iniziate la seconda asperità del percorso che sale tra gli ulivi fino al km 28,4. Da qui, proseguite pedalando in un susseguirsi di saliscendi sempre lungo lo sterrato principale fino al chilometro 30,3. In prossimità di un incrocio, girate a destra e poi subito a sinistra in via Borghettaccio. Al chilometro 30,8 girate a sinistra e reimmettetevi sull'asfalto che in pochi chilometri vi riconduce alla strada principale (km 33) dove, svoltando a destra si risale fino al centro di Assisi.
 

La bellezza del paesaggio che caratterizza l'itinerario, che in gran parte si sviluppa all'interno del Parco Regionale del Monte Subasio, vi ripagherà di ogni sforzo. Assolutamente da vedere lungo questo percorso, il centro storico di Assisi, dichiarato dall'Unesco Patrimonio Mondiale dell'Umanità. Qui, potete visitare la Basilica di Santa Chiara, il convento di San Domenico e la splendida Basilica di San Francesco. Appena fuori dalle mura, a dominare la città, c'è la superba rocca Maggiore, ricostruita nel 1367 dal Cardinale Albornoz su una precedente struttura (1174) di un antico castello feudale. Da vedere anche il centro di Spello: pur mostrandosi con caratteristiche medievali, questo borgo ha mantenuto molte testimonianze di quando fu colonia romana, come il teatro, l'anfiteatro, le terme e il cosiddetto Arco di Augusto. Tra gli edifici religiosi è notevole la chiesa di Santa Maria Maggiore (XII-XIII secolo), che racchiude tesori dell'arte come affreschi del Pintoricchio e dipinti del Perugino. Appena fuori Spello poi, si trova Villa Fidelia (XVI secolo), edificata dove un tempo sorgevano il Tempio di Venere, il Teatro e le Terme, che ospita una ricca collezione di quadri, sculture e oggetti di antiquariato.