Suddivisa in ventisei sale, cui si aggiungono ulteriori spazi espositivi dedicati a mostre temporanee, la pinacoteca comprende opere dal XIV al XX secolo, gran parte delle quali acquisite alla pubblica proprietà in seguito alle demaniazioni postunitarie. Testimoniano la vitalità artistica dell'area, al centro di importanti vie di comunicazione e di scambi culturali tra aree diverse, pregevoli opere di artisti in gran parte forestieri: Raffaello, Luca Signorelli, Domenico Ghirlandaio, Andrea Della Robbia, Lorenzo Ghiberti, Antonio Vivarini, Raffaellino del Colle, Pomarancio e Santi di Tito.

In ambienti inaugurati nel 2006 trovano sede tre importanti donazioni: la gipsoteca dello scultore tifernate Elmo Palazzi (1871-1915), una collezione di bronzi realizzati da Bruno Bartoccini (1910- 2001), e la collezione Ruggieri, che raccoglie una ventina di quadri di artisti italiani del Novecento.Nelle sale al piano seminterrato è gratuitamente visitabile un'ampia collezione malacologica.

Il mobilio esposto nelle diverse sale della pinacoteca non apparteneva all'arredamento originale del palazzo, ma fa parte della donazione che Elia Volpi, responsabile dell'ultimo restauro dell'edificio e proprietario, fece al Comune di Città di Castello nel 1912. Tavoli cinquecenteschi di fattura tipicamente umbra o di provenienza conventuale, serie di sedie e seggioloni sei-settecenteschi ne sono un esempio.
I pezzi di maggior pregio ed interesse sono gli arredi provenienti da chiese e monasteri castellani. Interessante il gruppo di stalli gotici, intagliato e decorato a tarsie, attribuito alla bottega del più noto legnaiolo fiorentino del primo Quattrocento, Manno di Benincasa Mannucci. Il coro, l'armadio da sagrestia, firmato e datato 1501 e il grande sarcofago intagliato e dorato, che custodiva il corpo della Beata Margherita, sono fra i documenti dell'altissima qualità delle manifatture umbre alla fine del Cinquecento.